一無色片

　　染色結(jié)束后，切片中見不到任何陽性信號。這是比較常見的現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，有兩種可能：1、真陰性結(jié)果：整個染色過程沒有出現(xiàn)問題，組織或細(xì)胞確實(shí)不表達(dá)與抗體相關(guān)的抗原。2、假陰性結(jié)果：即此陰性結(jié)果不是真實(shí)的反映。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：（1）切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況，可能是實(shí)驗(yàn)人員選擇錯了切片或選錯了抗體。獲得正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結(jié)果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片是至關(guān)重要的。（2）染色過程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問題。比如，組織未進(jìn)行抗原修復(fù)，有的組織必須經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測抗原表達(dá)；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見于染色過程中漏掉了某一環(huán)節(jié)，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結(jié)束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現(xiàn)棕色。如果出現(xiàn)了，證明三抗和DAB的配制過程沒有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現(xiàn)任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問題肯定在三抗或DAB的配制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問題可能的原因。

　　解決陰性染色的問題非常簡單，就是設(shè)立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達(dá)，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時待測樣本仍為陰性，便是真實(shí)的陰性，說明組織或細(xì)胞沒有相應(yīng)的抗原表達(dá)。反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應(yīng)一一尋找原因。陽性對照包括兩種，一種稱為“自身對照”或“內(nèi)部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結(jié)中存在T和B細(xì)胞抗原，CD20或CD3都應(yīng)該有表達(dá)。自身對照是一種比較理想的對照，對照和測試組織或細(xì)胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗(yàn)條件下，結(jié)果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對照片時選擇既有病變組織同時又有正常組織的部分，這樣有利于對比。另一種稱為“外部對照”，有時在待測的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標(biāo)本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原，如果病變出現(xiàn)陽性反應(yīng)結(jié)果，尚能提示是惡黑，但是如果出現(xiàn)陰性結(jié)果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問題。因此，應(yīng)另外設(shè)立一個已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為“外部對照”。在實(shí)際工作中需要設(shè)立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽性對照，工作量會很大。為了解決這個問題，目前國內(nèi)外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片等，其連續(xù)切片儲備待用，需要時取出一張便可作為陽性對照。另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為陽性對照，因?yàn)榕c人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數(shù)常用的抗體。